Kupfervermittelte Sauerstoffaktivierung

 

M. Sc. Ramona Jurgeleit, M. Sc. Rebecca Schneider, M. Sc. Alex Koch und Prof. Dr. Felix Tuczek

 

Kupfer und seine biologische Bedeutung

Das Element Kupfer, welches zu den Übergangsmetallen zählt, stellt für alle Lebewesen ein essentielles Spurenelement dar und ist nach Eisen und Zink das dritthäufigste Übergangsmetall im menschlichen Körper. In den beiden Oxidationsstufen +I und +II zeigt Kupfer besondere Eigenschaften, welche im Hinblick auf elektronenübertragende Enzymreaktionen, wie zum Beispiel durch Oxidasen und Oxygenasen katalysierte Reaktionen, von Bedeutung sind. Diese beiden Enzymklassen sind die, in denen Kupfer-Zentren am Häufigsten auftreten. Der Übergang zwischen den beiden erwähnten Oxidationsstufen läuft sehr leicht ab, daher stellt das Kupferion einen hervorragenden Katalysator für Redoxreaktionen dar.

Dem Element Kupfer kommt, als Metall im aktiven Zentrum von Enzymen, eine große Bedeutung zu. Dies ist mit einer großen Variabilität der aktiven Zentren, die einerseits auf den verschiedenen möglichen Koordinationsgeometrien der Kupferzentren, als auch auf der unterschiedlichen Art der koordinierenden Liganden fußt, zu begründen. Hinsichtlich ihres strukturellen Aufbaus und ihrer Eigenschaften in Bezug auf spektroskopische Untersuchungen werden die aktiven Zentren von kupferhaltigen Proteinen in acht verschiedene Klassen (Typ 1 – 4, CuA, CuB, CuZ und Cu0) unterteilt, wobei hier nur auf die drei wichtigsten Typen mit bekannten Vertretern eingegangen werden soll (Abbildung 1).

bekannte Kupferproteine
Abbildung 1. Überblick der drei bekanntesten Typen von Kupferproteinen; a) Plastocyanin, Cu-Typ 1, b) Superoxid Dismutase, Cu-Typ 2, c) Tyrosinase, Cu-Typ 3.
 

Neben ihren unterschiedlichen strukturellen Eigenschaften weisen die verschiedenen Typen auch Unterschiede bezüglich ihrer Funktion als Enzym auf (Abbildung 2). Während die Typ 1 Kupferzentren, z. B. das Azurin, an Elektronentransferprozessen beteiligt sind, kommt den Typ 2 und Typ 3 Kupferproteinen die Funktion der Sauerstoffaktivierung und des Sauerstofftransports zu. Bekannte Vertreter sind die Galactose-Oxidase bzw. die Catechol-Oxidase und die Tyrosinase.

Reaktionen von Kupferproteinen
Abbildung 2. Überblick verschiedener Reaktionen, die durch Typ 1, -2 und -3 Kupferenzyme katalysiert werden.
 

Tyrosinase

Das aktive Zentrum der Typ 3 Kupferenzyme ist aus einem binuklearen Kupferzentrum aufgebaut, indem jedes Kupfer-Ion jeweils von drei Histidin-Resten koordiniert ist (Abbildung 3, rechts). Weiterhin sind Typ 3 Kupferproteine in der Lage den Sauerstoff als Peroxid in der charakteristischen µ-η2:η2- (side-on-verbrückenden) Geometrie zu binden. In dieser sog. oxy-Form ändert sich der Oxidationszustand der Kupferionen von +I zu +II. Durch die Aufnahme von Sauerstoff können Typ 3 Kupferenzyme wichtige Aufgaben in Organismen übernehmen.

Während Hämocyanin (Hc) den Sauerstofftransport in Arthropoden und Mollusken vermittelt, sind Catechol-Oxidasen (CO) verantwortlich für die Oxidation von Catecholen zu den entsprechenden ortho-Chinonen (Abbildung 3, oben links). Das ubiquitäre Typ 3 Kupferprotein Tyrosinase (Ty) katalysiert im Gegensatz dazu, ausgehend von Monophenolen, die Bildung von ortho-Chinonen. Die Umwandlung von L-Tyrosin zu L-DOPAchinon erfolgt dabei in einem zweistufigen Prozess, beginnend mit einer aromatischen ortho-Hydroxylierung des Phenols zum Catechol und der anschließenden Zwei-Elektronen-Oxidation zum entsprechenden Chinon. Das gebildete L-DOPAchinon ist dann in der Lage spontan zum wichtigen Biopigment Melanin zu polymerisieren (Abbildung 3).

Reaktionskaskade der Melanogenese
Abbildung 3. Aktives Zentrum der oxy-Tyrosinase (Streptomyces castaneoglobisporus) (rechts) und eine Übersicht der Melaninbiosynthese (Melanogenese).
 

Auf diese Weise ist die Tyrosinase an Bräunungsprozessen, der Wundheilung und der Immunantwort beteiligt, weshalb reges Interesse zur Aufklärung der beteiligten Prozesse aus verschiedensten Bereichen der Medizin, Pharmakologie, Kosmetik und Landwirtschaft besteht.

Arbeitsmethoden und Forschungsschwerpunkt unserer Arbeitsgruppe

Unsere Arbeitsgruppe beschäftigt sich mit der Synthese, Charakterisierung und Untersuchung niedermolekularer Modellsysteme kupferhaltiger Monooxygenasen. Eines der Enzyme, dass sich im Fokus unserer Forschungsbemühungen befindet, ist die Tyrosinase Wertvolle Informationen über die Tyrosinase wurden durch spektroskopische Untersuchungen und Reaktivitätsstudien an niedermolekularen Modellsystemen, welche das Typ 3 Kupferzentrum des Enzyms nachbilden, erhalten. Die Entwicklung neuer, katalytischer Modellsysteme für die Tyrosinase, ist daher von großem Interesse, um den genauen Ablauf der Reaktion von L-Tyrosin zu L-DOPAchinon und die strukturellen Anforderungen für eine Tyrosinaseaktivität besser zu verstehen. Im Rahmen dieser Forschung befassten und befassen wir uns mit folgenden Fragestellungen:

  • Kann eine katalytische Hydroxylierung von Phenolen durch einkernige Kupfer(I)-Komplexe vermittelt werden?[R1]

  • Über welchen Mechanismus verläuft die ortho-Hydroxylierung externer, phenolischer Substrate und können Intermediate des Katalysezyklus isoliert werden?[P1, P2, P6, P11]

  • Kann eine aromatische Hydroxylierung eines an den Liganden des Modellsystems gebundenen Phenols nachgewiesen werden und ist eine externe Base für die anschließende Chinonbildung unabdingbar?[R2, P5]

  • Wie wird die katalytische Reaktivität durch die Art des Heterozyklus im Ligandgerüst beeinflusst?[P4, P7, P8, P9, P10]

  • Welche Rolle bezüglich der katalytischen Chinonbildung spielen die elektronischen Eigenschaften des eingesetzten Substrats?[P7, P9, P10]

Zur Bearbeitung dieser Fragen ist es unabdingbar die Enzymstruktur zu betrachten [R5], um möglichst nah an dem natürlichen System zu arbeiten.

Im Folgenden soll zunächst kurz auf einige wichtige Arbeitsmethoden und anschließend auf unsere Forschung bezüglich der Tyrosinase und der genannten Fragestellungen eingegangen werden.
Die Synthese von Modellsystemen läuft typischerweise in vier Schritten ab. Am Anfang steht die theoretische Betrachtung des designten Modellsystems mittels DFT-Rechnungen. Im Anschluss erfolgt die Ligandsynthese, die Komplexierung der Liganden mit Cu(I)-Precursoren und die Oxygenierung der dargestellten Komplexe.
 

1. Arbeiten unter Inertgas

Da sowohl einige Zwischenstufen der Liganden, als auch die entsprechenden Komplexe an der Luft instabil sind, ist das Arbeiten unter Intergas (N2/ Argon) ein integraler Bestandteil unserer Arbeit. Synthesen unter Inertgas werden mithilfe von Schlenk-Linien durchgeführt. Für die Probenpräparation, Einwaage der Edukte und weitere Arbeiten unter O2-Ausschluss steht darüber hinaus eine GloveBox zur Verfügung.

 

2. (Tieftemperatur-)UV/vis-Spektroskopie

Nach der Umsetzung der zuvor synthetisierten Liganden mit einem Cu(I)-Precursor werden die so erhaltenen Cu(I)-Komplexe auf ihre Reaktivität gegenüber Sauerstoff untersucht. Kupfer-Sauerstoff-Intermediate zeigen oft charakteristische Absorptionen in UV/vis-Spektren, sind jedoch zumeist nur bei tiefen Temperaturen stabil, weshalb zu deren Untersuchung die Tieftemperatur-UV/vis-Spektroskopie (TT-UV/vis) zur Verfügung steht (Abbildung 4).

Aufbau des TT-UV/vis-Spektrometers
Abbildung 4. Aufbau des TT-UV/vis-Spektrometers.
 

Eine Küvette, welche sich am Ende einer Lanze befindet, wird mit der verdünnten Probelösung befüllt und mithilfe eines Cryostaten auf 183 K abgekühlt. Im Anschluss erfolgt das Einleiten von Sauerstoff in die Probenlösung und schrittweises Aufwärmen bis auf Raumtemperatur. Dabei wird die Bildung der Kupfer-Sauerstoff-Spezies mit der Aufnahme von UV/vis-Spektren verfolgt (Abbildung 5).

TT-UV/vis-Spektren des dmpzea-Systems
Abbildung 5. Tieftemperatur-UV/vis-Spektren während der Bildung eines µ-η2:η2-Peroxo-Intermediats ausgehend von dem Cu(I)-Komplex mit dmpzea bei 183 K.[P11]
 

3. Modellsysteme für die Tyrosinase

Im Jahr 2010 gelang uns die Entwicklung und Synthese des ersten katalytischen Modellsystems der Tyrosinase, basierend auf einem mononuklearen Kupfer(I)-Precursor.[R1] Der Precursor-Komplex ist aus einem bidentaten Iminopyridin-Liganden (Schema 1, Lpy1) aufgebaut. Das Lpy1-System katalysiert die Umsetzung des Monophenols (2,4-Di-tert-butylphenol, DTBP-H) in das entsprechende ortho-Chinon (DTBQ) mit einer katalytischen Umsatzzahl (turnover number, TON) von 22. Neben dem experimentellen Nachweis der Monophenolase-Aktivität konnte darüber hinaus für das Lpy1-System mithilfe von DFT-Rechnungen ein Katalysezyklus postuliert werden (Abbildung 6).[R1, P4] Dabei wird zunächst der mononukleare Kupfer(I) Precursor-Komplex in das Intermediat 2 überführt, welches anstelle von Acetonitril ein Triethylamin sowie ein Substratmolekül als Liganden aufweist. In Anwesenheit von Sauerstoff wird anschließend ein Peroxokomplex generiert. Ein weiteres Substratmolekül koordiniert dann an ein Kupferzentrum (3), bevor es zum elektrophilen Angriff des Peroxo-Kerns in ortho-Stellung kommt. Das gebildete Catecholato-Addukt 4 spaltet sich im darauffolgenden Schritt als ortho-Chinon ab und der Zyklus beginnt erneut (Abbildung 6).

Postulierter Katalysezyklus der Modellsysteme
Abbildung 6. Postulierter katalytischer Zyklus für unsere untersuchten Systeme.[R1, R2, P1, P4]
 

Die Bildung eines solchen Catecholato-Addukts konnte überdies durch eine stöchiometrische Oxygenierung des Substrats auch experimentell nachgewiesen werden.[R1, R2, P1, P4]

Die weitere Aufklärung des katalytischen Zyklus und die Synthese von Modellsystemen mit einer noch höheren Umsatzzahl stand in den folgenden Jahren im Fokus der Forschung unserer Gruppe. So konnte mit dem Lbzm1-System (Schema 1) 2013 ein Modellsystem, welches die Umsetzung von 2,4-DTBP-H mit einer TON von 31 katalysiert, erhalten werden. Darüber hinaus konnte mittels quantenchemischer Rechnungen für das Catecholato-Addukt ein Hinweis auf eine gemischtvalente Semichinon-Struktur erhalten werden.[P2] In aktuellen Arbeiten wurden unter Anderem flexible, tridentate Pyrazolethylamin-Liganden (Schema 1, pzea/ dmpzea) hergestellt. Die Verwendung tridentater Liganden sollte dabei den µ-η2:η2-Peroxo-Komplex und weitere Intermediate im katalytischen Zyklus stabilisieren. In der Tat konnte für das dmpzea-System eine höhere µ-η2:η2-Peroxo-Ausbeute nachgewiesen werden. Eine Reaktivität gegenüber externen Substraten war jedoch nicht festzustellen.[P11]

Ligandenübersicht-mononuklear
Schema 1. Auf Basis des Liganden Lpy1 konnte durch Weiterentwicklung eine Reihe weiterer Systeme erhalten werden, die in den vergangen 10 Jahren untersucht wurden. Es sind die korrespondierenden TON (Umsatzzahl) und TOF (Umsatzrate nach 15 min) für die Umsetzung von 2,4-Di-tert-butylphenol angegeben.[R4, P8-P11]
 

Die Frage, welche elektronischen Eigenschaften die katalytische Reaktivität der Tyrosinase beeinflussen, ist ein weiterer wichtiger Bestandteil unserer Forschung. Um den Einfluss des N-Donors auf die Reaktivität der Systeme zu untersuchen, wurden in den letzten Jahren neue Modellsysteme mit verschiedenen N-Heterozyklen als Donoren hergestellt (Schema 1). Im Gegensatz zu Lpy1 lieferte schon Lbzm1, bei dem der Pyridinring durch Benzimidazol ausgetauscht wurde, eine wesentlich höhere katalytische Aktivität.[P2] Bei den Liganden Lhpz1 und Lhpz2 ist der Pyridinring im Gegensatz dazu gegen ein Pyrazol bzw. ein 3,5-Dimethylpyrazol substituiert. Die TON ist in beiden Fällen in den Pyrazolsubstituierten Systemen höher als bei Lpy1.[P4] Zusätzlich wurden weitere Modellsysteme dargestellt, bei denen ausschließlich Herterozyklen als N>-Donoren vorhanden sind. Dabei wurde u.a. festgestellt, dass die katalytische Aktivität von Pyridin (Schema 1, DPM) über Pyrazol (Schema 1, PMP bzw. BPM) hin zu Triazol (Schema 1, TMP), bei Variation eines der beiden Heterozyklen, ansteigt. Der –I-Effekt der benachbarten Atome im Pyrazol und Triazol verringert die Elektronendichte, welche vom N-Donor an den Kupfer-Sauerstoff-Kern übertragen werden kann. Dieser wird somit elektrophiler, wodurch der Angriff am elektronenreichen Substrat erleichtert wird. Dementsprechend steigen sowohl die TON als auch die TOF in der Reihe vom inaktiven DPM über PMP und BPM zu TPM an.[R1, P7, P9, P10] Die TON, wie auch die TOF, werden anhand des Anstiegs der für das ortho>-Chinon (DTBQ) charakteristischen Absorptionsbande bei 407 nm ermittelt (Abbildung 7).

Reaktivität TMP3-Komplex
Abbildung 7. Oxygenierung einer 500 μM Lösung von CuTMP3 in CH2Cl2 in Anwesenheit von 50 Äquiv. DTBP-H und 100 Äquiv. NEt3; Inset: TON sowie TOF pro Dikupfereinheit als Funktion gegen die Zeit.[P10]
 

Während die Verringerung der Elektronendichte am Kupfer-Sauerstoff-Kern also die katalytische Umsetzung von Monophenolen zu den entsprechenden Chinonen erhöht, führt die sterische Abschirmung der Kupferzentren durch die Substitution von Wasserstoffatomen im Ligandgerüst gegen Alkylgruppen (z.B. Methyl) dagegen zu einer Verringerung der katalytischen Aktivität. Einerseits wird durch den +I-Effekt der Alkylreste die Elektronendichte am Kupfer-Sauerstoff-Kern erhöht. Andererseits führt die sterische Abschirmung jedoch auch dazu, dass die Koordination des Substrates am Kupfer gehindert wird. Dieser Effekt kann zum Beispiel anhand der Differenz der TON von pzma und dmpzma (Schema 1), beobachtet werden.[P4, P7, P9, P11]

Durch die Entwicklung von Modellsystemen für die Tyrosinase in unserer Arbeitsgruppe konnten somit in den letzten Jahren einige wichtige Erkenntnisse zur Struktur und Wirkungsweise der Tyrosinase, sowie ihrer Reaktivität, erhalten werden.

 

Publications (seit 2010):

Reviews und Highlights:

 

[R5]  H. Decker, F. Tuczek

"The Recent Crystal Structure of Human Tyrosinase Related Protein 1 (HsTYRP1) Solves an Old Problem and Poses a New One”
Angew. Chem. Int. Ed. 2017, 56, 14352, DOI:10.1002/anie.201708214.


[R4]  J. N. Hamann, B. Herzigkeit, R. Jurgeleit and F. Tuczek

”Small-molecule models of tyrosinase: From ligand hydroxylation to catalytic monooxygenation of external substrates”
Coord. Chem. Rev. 2017, 334, 54-66, DOI: 10.1016/j.ccr.2016.07.009.


[R3]  M. Rolff, J. Schottenheim, H. Decker and F. Tuczek

"Copper-O2 Reactivity of Tyrosinase Models with External Monophenolic Substrates: Molecular mechanism and comparison with the enzyme"
Chem. Soc. Rev. 2011, DOI: 10.1039/C0CS00202J.


[R2]  M. Rolff, J. N. Hamann, F. Tuczek

"Benzylische Ligand-Hydroxylierung über ein Dikupfer-µ-η2:η2-Peroxo-Intermediat: drastische Reaktionsbeschleunigung durch Wasserstoffatom-Donoren"
Angew. Chem. 2011, 123, 7057, DOI:10.1002/ange.201102332.

 

M. Rolff, J. N. Hamann, F. Tuczek

"Benzylic Ligand Hydroxylation Starting from a Dicopper µ-η2:η2 Peroxo Intermediate: Dramatic Acceleration of the Reaction by Hydrogen-Atom Donors"
Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 6924, DOI:10.1002/anie.201102332.


[R1]  M. Rolff, J. Schottenheim, G. Peters, F. Tuczek

"Das Erste Katalytische Tyrosinase-Modell Basierend auf einem Einkernigen Kupfer(I)komplex: Kinetik und Mechanismus"
Angew. Chem. 2010, 122, 6583–6587, DOI: 10.1002/ange.201000973.


M. Rolff, J. Schottenheim, G. Peters, F. Tuczek

"The First Catalytic Tyrosinase Model System Based on a Mononuclear Copper(I) Complex: Kinetics and Mechanism"
Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 6438–6442, DOI: 10.1002/anie.201000973.


Weitere Veröffentlichungen:


[P11]  B. Herzigkeit, R. Jurgeleit, B. M. Flöser, N. E. Meißner, T. A. Engesser, C. Näther and F. Tuczek

"Employing linear tridentate ligands with pyrazole endgroups in catalytic tyrosinase model chemistry: Does hemilability matter?”
Eur. J. Inorg. Chem. 2019, 2258-2266, DOI: 10.1002/ejic.201900242.


[P10]  B. Herzigkeit, B. M. Flöser, N. E. Meißner, T. A. Engesser and F. Tuczek

"Click.Coordinate.Catalyze.Using CuAAC Click Ligands in Small-Molecule Model Chemistry of Tyrosinase”
ChemCatChem. 2018, 10, 5402-5405, DOI: 10.1002/cctc.201801606.


[P9]  B. Herzigkeit, B. M. Flöser, T. A. Engesser, C. Näther and F. Tuczek

"Tyrosinase model systems supported by pyrazolylmethylpyridine ligands: electronic and steric factors influencing the catalytic activity and impact of complex equilibria in solution”
Eur. J. Inorg. Chem. 2018, 3058-3069, DOI: 10.1002/ejic.201800319.


[P8]  F. Wendt, C. Näther and F. Tuczek

”Tyrosinase and Catechol Oxidase Activity of Copper(I) Complexes Supported by Imidazole-Based Ligands: Structure-Reactivity Correlations”
J. Biol. Inorg. Chem. 2016, 21(5-6), 777-792, DOI: 10.1007/s00775-016-1370-y.


[P7]  J. N. Hamann, R. Schneider and F. Tuczek

"Catalytic oxygenation of various monophenols by copper(I) complexes with bis(pyrazolyl)methane ligands: Differences in reactivity"
J. Coord. Chem. 2015, 68(17-18), 3259-3271, DOI: 10.1080/00958972.2015.1074191.


[P6]  J. Schottenheim, C. Gernert, B. Herzigkeit, J. Krahmer, F. Tuczek

"Catalytic Models of Tyrosinase: Reactivity Differences between Systems Based on Mono- and Binucleating Ligands"
Eur. J. Inorg. Chem. 2015, published online, DOI: 10.1002/ejic.201500029.


[P5]  J. N. Hamann, M. Rolff and F. Tuczek

"Monooxygenation of an appended phenol in a model system of tyrosinase: Implications on the enzymatic reaction mechanism"
Dalton Trans. 2015, 44, 3251-3258, DOI: 10.1039/C4DT03010A.


[P4]  J. N. Hamann, F. Tuczek

"New catalytic model systems of tyrosinase: fine tuning of the reactivity with pyrazole-based N-donor ligands"
Chem. Comm. 2014, 50(18), 2298, DOI: 10.1039/C3CC47888B.


[P3]  F. Wendt, M. Rolff, W. Thimm, C. Näther, F. Tuczek

"A Small-molecule Model System of Galactose Oxidase: Geometry, Reactivity and Electronic Structure"
Z. Anorg. Allg. Chem. 2013, 639(14), 2502, DOI: 10.1002/zaac.201300475.


[P2]  J. Schottenheim, N. Fateeva, W. Thimm, J. Krahmer, F. Tuczek

"Catalytic conversion of monophenols to ortho-quinones in a tyrosinase-like fashion: Towards more biomimetic and more efficient model systems"
ZAAC Special Issue "Bioinorganic Chemistry: From Fundamentals to Applications" (B. Krebs, J. Reedijk, Eds.) 2013, 8, 1491, DOI: 10.1002/zaac.201300065.


[P1]  M. Rolff, J. Schottenheim, F. Tuczek

"Monooxygenation of External Phenolic Substrates in Small-Molecule Dicopper Complexes: Implications on the Reaction Mechanism of Tyrosinase"
J. Coord. Chem. 2010, 63, 2382-2399, DOI: 10.1080/00958972.2010.503273.