Kupfervermittelte Sauerstoffaktivierung

Kupfergruppe Sauerstoffaktivierung:


Dipl.-Chem. Franziska Wendt, M. Sc. Jessica Hamann, M. Sc. Benjamin Herzigkeit, B. Sc. Ramona Jurgeleit and Prof. Dr. Felix Tuczek

 

Das Element Kupfer, welches zu den Übergangsmetallen zählt, stellt für alle Lebewesen ein essentielles Spurenelement dar und ist nach Eisen und Zink das dritthäufigste Übergangsmetall in Organismen. In den beiden Oxidationsstufen +I und +II zeigt Kupfer besondere Eigenschaften, welche im Hinblick auf elektronenübertragende Enzymreaktionen, beispielsweise durch Oxidasen und Oxygenasen katalysierte Reaktionen, von Bedeutung sind. Diese beiden Enzymklassen sind die, in denen Kupfer-Zentren am häufigsten auftreten. Der Übergang zwischen den beiden erwähnten Oxidationsstufen läuft sehr leicht ab, daher stellt das Kupferion einen hervorragenden Katalysator für Redoxreaktionen dar.

Kupfer kommt in Proteinen vielseitige Funktionen zu, was sowohl auf den unterschiedlichen Koordinationsgeometrien der Kupferzentren beruht, als auch auf der unterschiedlichen Wahl der koordinierenden Liganden. Hinsichtlich ihres strukturellen Aufbaus und ihrer Eigenschaften in Bezug auf spektroskopische Untersuchungen werden die aktiven Zentren von kupferhaltigen Proteinen in drei Typen unterteilt (Abbildung 1; aktuell sind sieben verschiedene Klassen bekannt, die drei wichtigsten werden angesprochen).

 

Abbildung 1

Abbildung 1. Überblick der drei bekanntesten Typen von Kupferproteinen; a) Plastocyanin, Cu-Typ 1, b) Superoxide Dismutase, Cu-Typ 2, c) Tyrosinase, Cu-Typ 3.

 

Neben ihren unterschiedlichen strukturellen Eigenschaften weisen die verschieden Typen auch Unterschiede bezüglich ihrer Funktion als Enzym auf (Abbildung 2). Während die Typ 1 Kupferzentren an Elektronentransferprozessen beteiligt sind, kommt den Typ 2 und Typ 3 Kupferproteinen die Funktion der Sauerstoffaktivierung und des Sauerstofftransports zu.

 

null

Abbildung 2. Überblick verschiedener Reaktionen, die durch Typ 1, 2 und 3 Kupferenzyme katalysiert werden.

 

Unsere Arbeitsgruppe beschäftigt sich hauptsächlich mit den Kupferproteinen der Klasse der binuklearen Typ 3 Enzyme, zu der die Tyrosinase, die Catechol Oxidase und das Hämocyanin gehören.

Das ubiquitäre Typ 3 Kupferprotein Tyrosinase (Ty) katalysiert, ausgehend von Monophenolen, die Bildung von ortho-Chinonen. Die Umwandlung von Tyrosin zu Dopachinon erfolgt in einem zweistufigen Prozess, beginnend mit einer aromatischen ortho-Hydroxylierung des Phenols zum Catechol und der anschließenden Zwei-Elektronen Oxidation zum entsprechenden Chinon. Das gebildete Dopachinon ist dann in der Lage spontan zum wichtigen Pigment Melanin zu polymerisieren (Abbildung 3, unten).

Das aktive Zentrum der Tyrosinase ist aus einem binuklearen Kupferzentrum aufgebaut, indem jedes Kupfer-Ion jeweils von drei Histidin-Resten koordiniert ist (Abbildung 3, links). Hämocyanin (Hc) und Catechol-Oxidase (CO) sind ebenfalls wichtige Typ 3 Kupferproteine, weisen aber, trotz ihrer strukturellen Ähnlichkeit, bemerkenswerte Unterschiede in ihrer Reaktivität zur Tyrosinase auf. Hämocyanin vermittelt den Sauerstofftransport in Arthropoden und Mollusken, wohingegen Catechol Oxidasen verantwortlich für die Oxidation von Catecholen zu den entsprechenden ortho-Chinonen sind (Abbildung 3, oben). All diese Typ 3 Kupferproteine weisen ein sehr ähnliches aktives Zentrum auf und binden den Sauerstoff als Peroxid in einer typischen µ-η22 (side on verbrückenden) Geometrie. In der sog. oxy-Form ändert sich der Oxidationszustand der Kupferionen von +I zu +II.

 

null

Abbildung 3. Aktives Zentrum der oxy-Tyrosinase (Streptomyces castaneoglobisporus) (links). Erste Schritte der Melaninsynthese.

 

Die Suche nach dem Grund für die unterschiedlichen Reaktivitäten innerhalb der Typ 3 Kupferenzyme hat schon lange das Interesse vieler Forscher geweckt und gehört auch zum Teil zu unserem Interessensgebiet.

Unser Hauptaugenmerk liegt jedoch an der Untersuchung von biomimetischen und niedermolekularen Modellsystemen des ubiquitären Tyrosinase-Enzyms. Die ortho-Chinone, welche durch die Katalyse der Tyrosinase gebildet werden, polymerisieren in einer darauffolgenden nicht-enzymatischen Reaktionskaskade zum Farbpigment Melanin. Auf diese Weise ist die Tyrosinase an Bräunungsprozessen, der Wundheilung und der Immunantwort beteiligt, weshalb reges Interesse zur Aufklärung der beteiligten Prozesse aus verschiedensten Bereichen der Medizin, Pharmakologie, Kosmetik und Landwirtschaft besteht.

Wertvolle Informationen über die Tyrosinase wurden durch spektroskopische Untersuchungen und Reaktivitätsstudien an niedermolekularen Modellsystemen, welche das Typ 3 Kupferzentrum nachbilden, erhalten. Zumeist führten diese Modelle jedoch nur in stöchiometrischer Weise zum gewünschten ortho-Chinon.

Eine besondere Herausforderung in der kupfervermittelten Sauerstoffaktivierung war die Synthese eines katalytischen Modellsystems der Tyrosinase. Es gelang uns schließlich 2010 das erste katalytische Modellsystem, basierend auf einem mononuklearen Kupfer(I)-Präkursor, für die Tyrosinase zu entwickeln. Der Präkursor-Komplex ist aufgebaut aus einem bidentaten Pyridin-Liganden (Lpy1, Schema 1, a). Das Lpy1-System katalysiert die Umsetzung des Monophenols (2,4-Di-tert-butylphenol) in das entsprechende ortho-Chinon (DTBQ) mit einer katalytischen Umsatzzahl (turnover number, TON) von 22.

 

null

Schema 1. Der Ligand Lpy1 des ersten mononuklearen katalytischen Modellsystems, b) Der Ligand Lbzm1 und die Liganden Lhpz1 und Lhpz2 (c und d).

 

Vor kurzem konnten wir ein zweites Modellsystem, welches als funktionelle Gruppe ein Benzimidazol enthält, präsentieren (Schema 1, b). Das neue Lbzm1-System weist mit einer TON von 31 und einer deutlich erhöhten Reaktionsgeschwindigkeit (turnover frequency, TOF) eine deutliche Steigerung zum Lpy1-System auf. Dabei wurde die Bildung des ortho-Chinons (DTBQ) mittels in situ UV/Vis-Spektroskopie durch den Anstieg der charakteristischen Absorptionsbande bei 407 nm verfolgt (Abbildung 4).

 

null

Abbildung 4. Oxygenierung einer 500 μmolaren Lösung von CuLbzm1 in CH2Cl2 in Anwesenheit von 50 Äquiv. DTBP-H und 100 Äquiv. NEt3; Inset: TON pro Dikupfereinheit als Funktion gegen die Zeit.

 

Um den Einfluss des Heterozyklus auf die Reaktivität der Systeme zu untersuchen, wurden zwei neue auf Pyrazoleinheiten-basierende Kupfer(I)-Komplexe als Modellsysteme (Lhpz1 und Lhpz2, Schema 1, c und d) hergestellt und untersucht. Im Vergleich mit den beiden vorher veröffentlichten Modellsystemen Lbmz1 (TON = 31) und Lpy1 (TON = 22) nehmen die Pyrazol-basierten Systeme bzgl. ihrer katalytischen Reaktivität eine intermediäre Position ein (Tabelle 1).

 

Tabelle 1. Darstellung aller mononuklearer Modellsysteme, angeordnet nach TON und TOF für die Umsetzung von DTBP-H zu DTBQ bei Raumtemperatur.
 

System Lpy1 Lhpz2 Lhpz1 Lbzm1
TON 22 23 29 31
TOF @ 15 min. 0.56 0.62 0.85 0.98

 

Offensichtlich besteht zwischen der TON und der TOF ein deutlicher Zusammenhang. Im Falle einer schnelleren katalytischen Reaktion, ist auch eine höhere Ausbeute des gebildeten ortho-Chinons zu beobachten. Wir nehmen an, dass eine höhere Reaktionsrate die Nebenreaktionen, die den Katalysator abbauen, verringert und somit zu einer höheren katalytischen Aktivität führt.

Weiterhin beschäftigen wir uns mit der Aufklärung des Reaktionszyklus für unsere Modellsysteme. Dafür untersuchen wir reaktive Intermediate aus dem Hydroxylierungsschritt, z.B. eine Catecholato-Kupfer(II)-Spezies 4 oder das wichtige side-on verbrückte Peroxo-Intermediat 3, welches den Sauerstoff im gleichen Modus wie im aktiven Zentrum des Enzyms bindet. Die Untersuchung der Intermediate soll zu einer besseren Aufklärung der einzelnen Reaktionsschritte in dem vorgeschlagenen Reaktionszyklus führen (Abbildung 5).

 

null

Abbildung 5. Postulierter katalytischer Zyklus für unsere untersuchten Systeme.

 

Neben unseren katalytischen Modellsystemen für das Typ 3 Kupferenzym Tyrosinase konnten wir außerdem noch ein niedermolekulares Modellsystem für das Typ 2 Kupferenzym Galactose Oxidase entwickeln.

Die Galactose Oxidase (GOase) ist ein mononukleares Kupferenzym aus der Klasse der Typ 2 Kupferenzyme. Die Koordinationssphäre des Kupferzentrums aus diesem extrazellulären Enzym weist eine verzerrt quadratisch pyramidale Geometrie auf (Abbildung 6).

 

null

Abbildung 6. Links: Das aktive Zentrum von Dactylium dendroides bei einem pH von 4.5 bestimmt durch Kristallstrukturanalyse (links). Reaktivität der GOase (rechts).

 

Wie die Glyoxal Oxidase gehört die GOase zur Familie der radikalischen Kupferoxidasen. Unter aeroben Bedingungen katalysiert sie in einer Zwei-Elektronen Oxidation die Umwandlung der D-Galactose und eine Reihe weiterer primärer Alkohole zu den entsprechenden Aldehyden unter gleichzeitiger Reduktion von molekularem Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid. Die Spezifität gegenüber primärer Alkohole ist äußerst gering. Eine Oxidation sekundärer Alkohole wurde noch nie beobachtet.

Daher synthetisierten wir ein niedermolekulares Modellsystem für die GOase mit dem schon bekannten tridentaten Liganden N-(2-hydroxyphenyl)-methyl-bis-(2-pyridylmethyl)-amin (L6-H). In der Tat zeigt der erhaltene Kupfer(I)-Komplex [Cu(I)(L6)]PF6 eine GOase-Aktivität bezüglich der Oxidation von Ethanol mit einer turnover number von 74 (Abbildung 7, links).

 

null

Abbildung 7. Oxidation einer 280 µM Lösung von [Cu(I)(L6)]PF6 in Ethanol in Anwesenheit von 4 Äquiv. NEt3 und anschließender Derivatisierung mit MBTH (links). UV/Vis-Spektrum von [(Cu(II))2(L6)2](PF6)2 (2.5 x 10-4 M, CH3CN) (gestrichelt) und [Cu(II)(L6·)(CH3CN)]X2 (X=PF6-, NO3-) bei 25 °C nach Zugabe einer äquimolaren Menge an CAN (durchgezogene Linie) (rechts).

 

Das Cu(II)-Phenoxyl Radikal [Cu(II)(L6·)(CH3CN)] konnte durch oxidative Spaltung des Dimers [(Cu(II))2(L6)2](PF6)2 nach einer literaturbekannten Vorschrift erzeugt werden. Anhand dieser Spezies konnten dann charakteristische UV/Vis-Eigenschaften, ähnlich derer des natürlichen Enzyms, detektiert werden (Abbildung 7, rechts).

 

 

Wir bieten:

Themen für Bachelor-, Master- und Doktorarbeiten in einem interessanten und relevanten Bereich der bioanorganischen Chemie mit medizinischem und biochemischem Hintergrund.

 

Wir erwarten:

 

  • Fundierte Kenntnisse in organischer und metallorganischer Chemie (Schlenk-Technik) sowie Koordinationschemie
  • Gutes Verständnis in physikalischer Chemie (UV/Vis-, Schwingungs- und NMR-Spektroskopie, Kinetik)
  • Interesse an Reaktivitätsstudien und Biochemie
  • Soft Skills und Teamwork in einem interdisziplinären Umfeld

 

Letzte Veröffentlichungen:

  • J. Schottenheim, C. Gernert, B. Herzigkeit, J. Krahmer, F. Tuczek
    "Catalytic Models of Tyrosinase: Reactivity Differences between Systems Based on Mono- and Binucleating Ligands"
    Eur. J. Inorg. Chem. 2015, published online, DOI: 10.1002/ejic.201500029.

  • J. N. Hamann, M. Rolff and F. Tuczek
    "Monooxygenation of an appended phenol in a model system of tyrosinase: Implications on the enzymatic reaction mechanism"
    Dalton Trans. 2015, 44, 3251-3258, DOI: 10.1039/C4DT03010A.

  • J. N. Hamann, F. Tuczek
    "New catalytic model systems of tyrosinase: fine tuning of the reactivity with pyrazole-based N-donor ligands"
    Chem. Comm. 2014, 50(18), 2298, DOI: 10.1039/C3CC47888B.

  • F. Wendt, M. Rolff, W. Thimm, C. Näther, F. Tuczek
    "A Small-molecule Model System of Galactose Oxidase: Geometry, Reactivity and Electronic Structure"
    Z. Anorg. Allg. Chem. 2013, 639(14), 2502, DOI: 10.1002/zaac.201300475.

  • J. Schottenheim, N. Fateeva, W. Thimm, J. Krahmer, F. Tuczek
    "Catalytic conversion of monophenols to ortho-quinones in a tyrosinase-like fashion: Towards more biomimetic and more efficient model systems"
    ZAAC Special Issue "Bioinorganic Chemistry: From Fundamentals to Applications" (B. Krebs, J. Reedijk, Eds.) 2013, 8, 1491, DOI: 10.1002/zaac.201300065.

  • M. Rolff, J. Schottenheim, H. Decker and F. Tuczek
    "Copper-O2 Reactivity of Tyrosinase Models with External Monophenolic Substrates: Molecular mechanism and comparison with the enzyme"
    Chem. Soc. Rev. 2011, DOI: 10.1039/C0CS00202J.

  • M. Rolff, J. N. Hamann, F. Tuczek
    "Benzylische Ligand-Hydroxylierung über ein Dikupfer-µ-η22-Peroxo-Intermediat: drastische Reaktionsbeschleunigung durch Wasserstoffatom-Donoren
    Angew. Chem. 2011, 123, 7057, DOI:10.1002/ange.201102332.


    M. Rolff, J. N. Hamann, F. Tuczek
    "Benzylic Ligand Hydroxylation Starting from a Dicopper µ-η22 Peroxo Intermediate: Dramatic Acceleration of the Reaction by Hydrogen-Atom Donors"
    Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 6924, DOI:10.1002/anie.201102332.

  • M. Rolff, J. Schottenheim, F. Tuczek
    "Monooxygenation of External Phenolic Substrates in Small-Molecule Dicopper Complexes: Implications on the Reaction Mechanism of Tyrosinase"
    J. Coord. Chem. 2010, 63, 2382-2399.

  • M. Rolff, J. Schottenheim, G. Peters, F. Tuczek
    "Das Erste Katalytische Tyrosinase-Modell Basierend auf einem Einkernigen Kupfer(I)komplex: Kinetik und Mechanismus"
    Angew. Chem. 2010, 122, 6583–6587.


    M. Rolff, J. Schottenheim, G. Peters, F. Tuczek
    "The First Catalytic Tyrosinase Model System Based on a Mononuclear Copper(I) Complex: Kinetics and Mechanism"
    Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 6438–6442.